宾美生物科技
首页 > 藻蓝平素识 > 医药级藻蓝素 >

藻蓝蛋白抗动脉粥样硬化中的感化研究

文章来源: 宾美生物科技 teammirza.com   发布时间: 2015-12-30 22:07 浏览: 

 动脉粥样硬化atherosclerosis AS是全身性疾

病高血脂高血压吸烟致继发性高脂血症的疾病
遗传身分和其他身分都能招致AS的产生今朝寻觅
经济安然有效的抗动脉粥样硬化药物成为当今医
学的一大年夜热点和困难[1]
动脉粥样硬化是一种慢性炎症和免疫性疾病
免疫和非免疫身分招致内皮功能混乱 从而启动动
脉粥样硬化的生长 补体是免疫体系中的重要效应
子大年夜量证据注解补系一切参与了动脉粥样硬化发
生生长的全部过程[2] 经研究证明补系一切的激活产
物如调理蛋白补体受体都可在动脉粥样硬化的病
灶特别是易损斑块和已决裂斑块中被探及并且经
过对人体病变的研究发明膜进击复合体的堆积量与
病灶停顿程度出现正相干而补体调理蛋白CD59就
是补体膜进击复合物MAC组装的一个关键调理
子具有克制补体膜进击复合物构成的感化[3] 脂质体
是由脂质双层分子构成的环形封闭泡囊作为基因转
移的非病毒载体具有没有毒应用便利无免疫源性
转染率较高的长处[4] 包埋目标基因后经过过程尾静脉注
射有必定的药物动力学感化[5] 钝顶螺旋藻Spirulinaplatensis
中的藻蓝蛋白C-phycocyaninCPC具有很
高的医疗价值如有改良血脂代谢抗氧化抗肿瘤
抗衰老进步机体免疫力等功能[6] 因其安然无毒水
溶性高含量高易提取等特点被广泛用于化妆品和
食品的添加剂 动脉粥样硬化是由内皮功能混乱引
起的 而藻蓝蛋白能促进植物细胞再生进而修复损
伤的内皮细胞并引诱坏逝世细胞凋亡进而调控机体的
内皮功能 且其改良血脂代谢和清除自在基等异物
的心思活性又能有效地克制高脂血症的产生 由此
推想 藻蓝蛋白对动脉粥样硬化的治疗具有必定的
积极感化
本文将补体调理蛋白CD59与CPC的特点结合
起来 经过过程对高脂饮食ApoE
-/-小鼠转染入CD59基
因CPC灌胃给药和CD59基因和CPC的结协作
用 研究CPC对动脉粥样硬化小鼠中CD59表达量
的影响 并商量CPC对ApoE
-/-小鼠的抗动脉粥样硬
化感化能否是经过过程促进CD59基因的表达来减缓或
克制动脉粥样硬化的产生生长 提醒藻蓝蛋白抗动
脉粥样硬化感化的机制
材料与办法
实验材料与仪器ApoE
-/-小鼠40只 雌雄参半
购自北京维通利华实验植物技巧公司 钝顶螺旋藻
片购自中国陆地大年夜学CD59基因高表达质粒CD59-pIRES
由青岛大年夜学医学院免疫学教研室供给脂质体
Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司胆
固醇购自Sigma公司 猪胆盐购自Solarbio公司抗
小 鼠CD59多 克 隆 抗 体 购 自 美 国Santa公 司
EndoFree Plasmid ezFlow Maxiprep Kit 无内毒本质
粒大年夜提试剂盒 购自BIOMIGA公司, RNAiso PLUS
试剂盒与PrimeScript RT-PCR Kit购自TaKaRa公
司 核酸蛋白测定仪购自Eppendorf公司台式恒温
振荡器购自太仓市华丽生化仪器厂高温高速离心计心境
KR-1500购自KUBOUA公司电子天平与颗粒制冰
机购自日本Sanyo公司
藻蓝蛋白的提取250 g钝顶螺旋藻片充分研磨
至粉状参加浓度为0.1 mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲
液PBS500 ml于4 浸泡30 min搅拌均匀-20
和38 反复冻融10次 静置30 min4 000 r/min离
心40 min 将上清液与等体积的饱和硫酸铵溶液混
匀在4 下盐析24 h 盐析所得沉淀4 000 r/min离
心40 min得藻蓝蛋白用50 ml PBS融化置于截留
相对分子质量为8 000~14 000的透析袋中1 000 ml
PBS透析去除铵离子得CPC混悬液[6] 核酸蛋白测
定仪测定CPC溶液的浓度
造模与给药办法
1.3.1 造模办法与给药剂量将40只ApoE
-/-小鼠随
机分为4组每组10只雌雄参半高脂饲料豢养配
方浅显饲料80% 猪大年夜油15% 胆固醇2% 全脂奶
粉1.5% 蛋黄粉1.3% 猪胆盐0.2%
[7] 给药剂量
CPC质量浓度为31.32 mg/ml以100 mg/kg停止灌胃
给药 每只小鼠 约30 g 每次给药0.1 mlCD59-pIRES
质粒质量浓度为117 g/ml 与脂质体包埋后
构成CD59-pIRES-脂质体复合物 此时质量浓度为
97.5 g/ml 每只小鼠每次打针约0.5 ml
1.3.2 分组办法第1组对比组只喂食高脂饲料作
为对比第2组CPC处理组采取CPC混悬液灌胃
法给药每周2次 第3组CD59处理组将CD59-pIRES-
脂质体复合物经过过程尾静脉打针给药 以完成
将CD59基因转染入小鼠细胞内的目标[8] 每周2次
第4组CD59+CPC处理组在停止CPC灌胃给药的
同时经过过程小鼠尾静脉打针CD59-pIRES-脂质体复合
物每周2次 将4组小鼠高脂饲料豢养并药物处理
12周
各组小鼠 和蛋白表达量的检测
1.4.1 RT-PCR检测血中CD59 mRNA程度小鼠空
腹12 h麻醉后摘眼球取血 用RNAiso PLUS试剂
盒提取4组小鼠全血的Total RNA 用PrimeScript
RT-PCR Kit试剂盒停止逆转录反响分解cDNA 再
取逆转录产品停止PCR扩增 根据引物设计软件设
计CD59上游引物5-TGGACAATCACAATGGGAA
TC -3 CD59下 游 引 物5-TGCTGCCAGAAATGGA
GTCAC-3 在PCR仪上按以下条件停止PCR反响
94 预变性2 min94 变性30 s47 退火1 min
68 延长2 min第2~4步40个轮回后68 终延长
7 min 扩增产品长度为378 bp 内参GAPDH扩增产
物长度为509 bp
1.4.2 Western blot检测组织细胞中CD59蛋白的表
达解剖4组小鼠切除肝脾心脏及主动脉等组
织放入预冷的心思盐水漂洗数次洗去血迹每组称
取0.45 g组织放入研钵按组织净质量裂解液体积
为12的比例参加裂解液停止研磨直至将组织研磨
成浆状 离心搜集蛋白 测定蛋白质量浓度 SDSPAGE
电泳分别蛋白将目标蛋白转印到PVDF膜上
封闭2 h分别参加兔抗鼠CD59 r 20 000 和兔抗
人内参-actin r 43 000 的一抗在4 孵育住宿
辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h 化学发光
显色经过过程Image J图象分析软件分析条带情况[9]
血脂生化程度的检测其他血液静置送检检测
血清中的各项生化目标总胆固醇TC 甘油三酯
TG 载脂蛋白B(ApoB)低密度脂蛋白LDL 高密
度脂蛋白HDL
[10]
染色不雅察动脉粥样硬化斑块开胸 分别主
动脉根部防止挤压取主动脉标本4%多聚甲醛固
定做持续白腊切片HE染色[11] 光学显微镜下不雅察
动脉粥样硬化斑块构成情况
统计学分析应用SPSS17.0统计软件分析处理
数据数据成果以的均数标准差表示组间比较采
用考验 0.05为统计学有明显性差别
成果
各组 小鼠 表达程度RTPCR成果经过过程凝胶图象分析
体系分析 各组小鼠之
间CD59 mRNA表达量有明显差别图1a 经过过程灰
度值分析 与对比组比拟CPC处理组CD59 mRNA
表达程度有所降低 解释藻蓝蛋白可以促进血细胞
CD59 mRNA的表达 CD59转染组CD59 mRNA水
平与对比组比拟也有明显降低这注解CD59基因已
成功转染入血细胞中图1b
各组 小鼠 蛋白的表达量经过过程
Western blot办法检测各组小鼠组织中CD59蛋白的
表达情况成果如图2a所示各组均检测到CD59的
不合表达程度的蛋白条带 各组蛋白条带的灰度值
经校订后分析显示图2b 与对比组比拟CD59处
理组CPC处理组与CPC+CD59处理组的CD59蛋白
表达量均有明显降低 且CPC+CD59处理组与对比
组CD59表达量的差别更加明显 成果注解CPC能
促进小鼠体内组织中的CD59蛋白的表达 CD59高
表达质粒的转染也在必定程度上增长了CD59蛋白
表达量这注解CD59基因已成功转染入小鼠组织细
胞中 以上成果与mRNA程度检测成果相分歧
各组 小鼠血清血脂生化程度的变更比
较同龄的高脂饮食对比组小鼠与正常饮食小鼠的各
项血清血脂生化目标表1 可以发明高脂饮食对比
组 小鼠的TGTCApoBLDL程度 均明显 升 高而
HDL程度降低且差别明显 0.05 证明ApoE
-/-小
鼠经高脂饲料豢养后构成高脂血症可以或许引诱动脉粥
样硬化的产生 对各实验组ApoE
-/-小鼠的血清血脂
程度停止比较发明与对比组比拟各组ApoB浓度
没有明显差别CPC处理组CD59处理组的TGTC
LDL浓度均有明显的降低趋势 0.05 但HDL浓
度与对比组比拟明显降低 而CD59+CPC处理组与
对比组比拟对血脂的调控感化更加明显 0.01
表2 成果注解CPC处理组与CD59处理组的血脂
程度均有明显地降低 并且CD59+CPC处理组比两
者伶仃给药后果更明显能更进一步的降低小鼠体内
的血脂程度减缓高脂血症的构成进而克制动脉粥
样斑块的构成
各组 小鼠动脉粥样硬化斑块的不雅察主
动脉标本经HE染色后镜下不雅察可以不雅察到各组
有明显的形状学差别[12] 高脂饮食对比组可见内膜明
显增厚完全性遭到破坏斑块构成中层腻滑肌细胞
经弹力板迁入内膜并产生增生转化斑块构成图
3a 与对比组比拟CPC处理组与CD59处理组都可
发明部分外膜明显增厚完全性开端遭到破坏但都
未见明显的动脉粥样硬化斑块构成 图3bc 而
CD59+CPC处理组管腔内侧有一层持续腻滑的内皮
细胞内膜无明显增厚未构成明显的斑块图3d
成果解释CPC与CD59均能在必定程度上减缓动脉
粥样硬化斑块的构成 并且CD59与CPC结合感化
比二者伶仃给药后果更明显能进一步的减缓乃至抑
制动脉粥样硬化斑块的构成
评论辩论
动脉粥样硬化atherosclerosis AS是全身性疾
病高血脂高血压吸烟致继发性高脂血症的疾病
遗传身分和其他身分都能招致AS的产生大年夜量风行
病学查询拜访证明高脂血症是动脉粥样硬化产生的风险
身分高脂血症是指血浆总胆固醇和甘油三酯异常增
高[1]
AS的严重程度随血浆胆固醇程度的降低而加
重今朝认为氧化LDLox-LDL 是最重要的致粥样
硬化因子 是毁伤内皮细胞和腻滑肌细胞的重要因
子 HDL可经过过程胆固醇逆向转运机制清除动脉壁的
胆固醇还有抗氧化感化可防止LDL的氧化并可抑
制LDL与内皮细胞的受体结合而增添其摄取[13] 因
此LDL浓度是断定AS的最好目标而HDL程度会
随着AS病变的减轻而降低本实验中ApoE
-/-小鼠高
脂饮食豢养12周后其TGTCLDL浓度比浅显豢养
的ApoE
-/-小鼠明显降低而HDL降低提示高脂血
症的构成表1 主动脉根部切片在光镜下不雅察发明
内膜增厚完全性遭到破坏有明显的动脉粥样硬化
斑块构成 上述成果注解动脉粥样硬化小鼠模型构
建成功
补系一切参与了动脉粥样硬化产生 生长的整
个过程 膜进击复合体的堆积量与病灶停顿程度呈
现正相干细胞分化抗原59(Cluster of differentiation
59, CD59)是一种糖基磷脂酰肌醇GPI锚固型糖蛋
白是补体膜进击复合物MAC组装的一个关键调
节子具有克制补体膜进击复合物构成的感化CD59
可与C8C9结合 妨碍MAC C5b-9复合物的生成
具有调控补体活性从而保护宿主细胞免受补体溶破
的感化[14] 国外研究发明CD59与创伤炎症和某些
肿瘤的产生有关[15] 本实验经过过程RT-PCR与Western
blot反响 证明了CPC可以或许促进小 鼠体内CD59
mRNA与CD59蛋白的表达量 别的静脉打针脂质
体复合物是转染目标基因的有效情势可进步生物利
费用[16] 本实验经过过程比较对比组与CD59处理组中
CD59的表达程度图1,图2 证明CD59基因经过过程
脂质体包埋小鼠尾静脉打针已被成功转染入小鼠血
液和组织细胞中
我们进一步针对藻蓝蛋白和CD59基因对ApoE
小鼠动脉粥样硬化的产生 生长的影响停止了商量
经过过程血清血脂生化目标检测和主动脉标本HE染色
发明 与对比组比拟CPC干涉与CD59转染均能在
必定程度高低降血脂程度表2 克制内膜增生和动
脉粥样硬化斑块构成图3bc d 减缓动脉粥样硬
化的产生并且CPC和CD59结合感化后果更明显
能进一步的减缓乃至克制动脉粥样硬化斑块的构成
综上成果 我们发明藻蓝蛋白可以促进动脉粥
样硬化小鼠体内CD59基因的表达而CD59又被证
实具有降低血脂水平和延缓动脉粥样硬化产生生长
的功能 那么我们推想藻蓝蛋白的抗动脉粥样硬化
感化能够是经过过程调控ApoE
-/-小鼠体内CD59基因的
表达来完成的 本研究为动脉粥样硬化的药物和基
因治疗供给了新思路和新办法
参考文献
[1] Kaperonis EA, Liapis CD, Kakisis JD. Infammation and
atherosclerosis[J] Eur J Vasc Endovasc Surg, 2006, 31(4):
386-393
[2] 刘永铭, 严 祥, 刘艳英补体与动脉粥样硬化[J] 中华心
血管病杂志, 2005, 33(9): 866-869
[3] 高美华, 王秋波, 王 冰, 等大年夜鼠2型糖尿病与CD59基
因突变的相干性研究[J] 免疫学杂志, 2007, 23(1): 23-29
[4] 杨 桦, 张 晰, 管红兵, 等脂质体介导基因转染活体眼
组织的研究[J] 眼科研究, 2000, 18(6): 227-230
[5] Chen J, Ping QN, Guo JX. Pharmacokinetics of lactone,
carboxylate and total 9 -nitrocamptothecin with different
doses and administration routes in rats [J]. Biopharm Drug
Dispos, 2006, 27(2): 53-59
[6] 李 冰, 张学成, 高美华, 等钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯
化新工艺[J] 陆地迷信, 2007, 31(8): 48-52
[7] 林 征, 吴小南, 汪家梨雄性SD大年夜鼠高脂血症模型饲料
配方的实验研究[J] 海峡预防医学杂志, 2007, 13(6): 56-57
[8] 田代志高脂饲料豢养及颈部打针硬化剂制造痰浊眩晕
上一篇:藻蓝蛋白纯粉胶囊    下一篇:没有了