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藻蓝蛋白的抗癌活性研究/抗癌新思路

文章来源: 宾美生物科技 teammirza.com   发布时间: 2013-09-03 00:24 浏览: 

藻蓝蛋白的抗癌活性研究*
王 勇1,钱 峰1,钱凯先1,董 强2
(1.浙江大年夜先生物技巧系,浙江杭州310027;2.山东省医学迷信院,山东济南250062)
摘 要:活细胞脱氢酶催化四唑盐(MTT)复原,生成溶于无机溶剂的蓝色甲月赞结晶,可定量反应细胞生
长.流式细胞技巧可根据细胞中DNA的质量分数来检测其所处的细胞周期.采取上述两种办法,研究
了藻蓝蛋白(PC)对HeLa细胞的抗癌活性.实验证明,PC对HeLa细胞发展有明显的克制造用,当PC
浓度为80 mg/L时对癌细胞的克制率达31.0%.初步认为这类克制机理为:PC使HeLa细胞由分解期
(S)或决裂期(M)向G1期改变和积集,细胞DNA分解衰减.
关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;四唑盐;流式细胞技巧;人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)
中图分类号:Q17     文献标识码:A     文章编号:1008-973X(2001)06-0672-04
螺旋藻(spirulina)的蛋白质高达50%~70%,个中,藻蓝蛋白(PC)占总蛋白的7%阁下.PC具
有特点性的接收光谱和荧光光谱是一种新鲜的荧光分子探针[1,2].随着生物学、医学、陆地药物学等
学科的生长,PC的生物活性已成为人们存眷的热点.饭岛登等(1982)发明PC可进步淋巴细胞活
性,加强机体抵抗力,继而在1983年发明PC能保持和促进正常受控细胞的功能,防止肿瘤的发展
和复发.抗肿瘤药物的体外挑选,平日有染料清除法,软琼脂克隆法和[3H]胸腺嘧啶掺入法等[3].但
这些办法精确度较差,反复性低、操作复杂,实验周期长.本文采取MTT法[4]和流式细胞技巧对
PC的抗癌活性停止了研究.
1 材料与办法
1.1 实验材料
HeLa细胞株(人子宫颈癌细胞),由浙江省肿瘤医院供给. PC由浙江大年夜先生物迷信与技巧系
细胞实验室纯化制备.
1.2 重要试剂
RPMI1640培养基(Gifco Co),胎牛血清(杭州四时青生物工程公司),胰蛋白酶trypsin (Difco
出口分装),MTT (Sigma Co),二甲基亚砜DMSO(Merck Co),Triton x-100(Sigma出口分装),
RNase A(Sigma),PI染料(Sigma)等.
1.3 溶液配制
PBS液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.020 g、Na2HPO4·H2O 1.56 g、KH2PO40.3 g, 15
磅灭菌15 min.
Hanks液:每升溶液含NaCl 18.40 g、kCl 0.40 g、CaCl20.14 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、
Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g, NaHCO30.35 g,葡萄糖1.00 g,酚红0.02 g,8磅灭菌
20 min.
D-Hanks液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.40 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、NaHCO30.35 g、
酚红0.02 g,8磅灭菌20min.
Trypsin-EDTA液:Trypsin (Difco 1:250) 0.5 g、EDTA 0.2 g,1 000 mL D-Hanks液,用
NaOH调pH至7.5,超滤除菌.
MTT液:用PBS深解成5 g/L,超滤除菌,4℃防止保存.
1.4 重要仪器
CO2主动细胞培养箱(VWR Model 1720, Forma Co. USA),酶标仪(EIA-11,上海四达生物
技巧研究所),流式细胞仪(Becton Dickinson Co. USA),细胞培养瓶(25 mL), 96孔板,24孔板
(华丽公司).
1.5 HeLa细胞的培养
无菌条件下,将HeLa细胞放于RPMI1640+20%胎牛血清的培养基中,置于37℃,5%的CO2
中培养,细胞构成单层落先行传代培养.
1.6 MTT法检没PC对HeLa细胞发展的克制造用
用Trysin-FDTA消化单层HeLa细胞,离心除去上清液,加培养液配成细胞悬液,并以1.0×
105细胞孔接入96孔板.共设5组,每组8孔,每孔100LL.培养24 h后,改换新鲜培养液.个中4
组为实验组,每组每孔分别参加100LL质量浓度为20、40、80、160 mg/L的PC液,使PC终究感化
质量浓度分别为10、20、40、80 mg/L.另外一组为空白对比组,每孔加100LL PBS.于37℃培养72
h后,参加MTT液,20LL/孔,37℃温育4 h,弃培养液,参加DMSO或无水乙醇( 100LL/孔),轻
微振荡使甲月赞结晶充分融化,用酶标仪在490 nm测定OD值,按以下公式计算克制率:
克制率=1-实验组OD-对比组OD-×100%.
以细胞浓度1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104个/孔,分别接入96孔板,每组8
孔培养24 h后,每孔加20LL MTT,用MTT法测各级490 nm OD值,并与细胞密度对应坐标图
得出线性归迹.
1.7 流式细胞技巧检测PC对HeLa细胞的抗癌活性办法
实验设4个组、每组3瓶,每瓶接入2 mL(2×105cells/mL)的细胞悬液,置于37℃,5%CO2
培养24 h后,实验组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分别参加1 g的PC液100、200、300LL,个中,Ⅰ、Ⅱ分别再补加
200、100LL PBS.空白组每瓶加300LL PBS.稍微振荡后,持续培养72 h.用Trysin-EDTA消化
各组,归并,3 000×10-6r/min离心10 min,弃上清液,用PBS离心洗濯细胞两次,70%乙醇固定.
然后再用PBS离心洗濯两次,细胞沉淀参加1 mL 1% Triton x-100(25℃,10 min), 3 000×10-6
r/min离心5 min弃上清,PBS洗濯两次,参加1 g/L RNaseA l mL (37℃, 10 min);然后室温下
用PI染色处理.振荡成均匀悬液,上机检测.
2 实验成果与评论辩论
2.1 PC对HeLa细胞的细胞毒感化
实验成果注解,PC对HeLa细胞的克制造用随PC浓度的进步而明显加强,克制率由3.5%增
至31.0%(表1)
表1 MTT检测的PC对HeLa细胞的克制造用
Tab.1 The inhibition activity of phycocyanin to Hela cells (MTT test)
PC浓度
/(mg·L-1)OD OD±S克制率/%
空 白0.625 0.621 0.650 0.643 0.619 0.627 0.636 0.619 0.630±0.012—
10 6.14 0.588 0.578 0.620 0.617 0.619 0.594 0.625 0.603±0.017 3.5
20 0.565 0.580 0.573 0.575 0.568 0.570 0.587 0.528 0.575±0.010 3.7
40 0.543 0.531 0.555 0.529 0.546 0.530 0.547 0.539 0.540±0.011 14.3
80 0.415 0.423 0.447 0.432 0.419 0.449 0.469 0.426 0.435±0.020 31.0
2.2 PC对HeLa细胞周期的影响
应用流式细胞仪对实验各组HeLa细胞DNA停止分析,表2为各组中细胞周期所占的比率.
从实验成果可知:PC可影响HeLa细胞由分解期(S)和决裂期(M)向G1期转移,并且这类转移随
PC浓度的加强而增长(图1). G1期细胞的比率渐渐增长,而(S+G2+M)期的细胞比率渐渐减小,
解释PC可使HeLa细胞停止于G1期,阻拦了细胞的DNA复制和决裂.
表2 样品中细胞周期各时代所占百分比
Tab.2 The percentage of different phyase in cell division cycle
PC浓度/(mg·L-1) G1/% S/% G2+M/% S+G2+M/%
空 白19.9 76.0 4.1 80.1
43.5 31.5 64.5 4.0 68.5
87.0 40.3 56.1 3.6 59.7
130.5 50.9 45.6 3.5 49.4
A:空白,B:PC终究浓度43.5Lg/mL,C:PC终究质量
浓度87.0Lg/mL,D:PC终究质量浓度130.5Lg/mL
图1 样品中G1期细胞所占百分比
Fig.1 The percentage of G1phase cell
  以上实验成果注解,PC对体外培养的HeLa细胞
有较好的克制发展感化,且随PC剂量从10 mg/L增
高至80 mg/L,克制率渐渐进步,可从3.5%降低至
31.0%.
流式细胞技巧可进一步对活细胞的细胞周期停止
检测,从细胞的DNA分解活性来检测PC的抗癌活
性. PC使HeLa细胞由S、G2、M期向G1期改变和积
聚,这是DNA分解运动期,解释DNA分解渐渐衰减.
初步认为这能够是PC克制癌细胞发展的机理.
经过过程RNaseA处理除去细胞中的RNA,再用
DNA染料PI对DNA停止荧光染色,流式细胞仪可
根据每个细胞中DNA的质量分数分辨出每个细胞所
处的细胞周期,并给出1万个细胞以上所处细胞周期
的同一数据.各类细胞周期的峰值和数据异常精确,使
本文研究成果非常靠得住.
PC是由藻蓝素与藻胆蛋白共价结合的大年夜分子复
合物.藻蓝素是一种分子质量约0.6 kD的开链四吡咯
环化合物,其分子上的乙叉基与藻胆蛋白多肽链上的半胱氨酸以硫醚键共价连接.在分别和纯化
PC时是按蛋白质纯化法式榜样停止的,PC是一种蓝色的蛋白质药物分子.
参考文献:
[1] VERNON J O I, GLAZER A N. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules
[J]. J Cell Biol, 1982, 93:981-986.
[2] HARDY R R, HAYAKAWA K, PARKS D R,et al. Demonstration of B-cell maturation in X-linked
immunodeficient mice by simultaneous three-colour immunofluorescence[J]. Nature, 1983, 306:270-272.
[3] HONGO T, FUJII Y, IGARASHI Y. An in vitro chemosensitivity test for the screening of anti-cancer drugs
in childhood leukemia[J]. Cancer, 1990, 15:65(6):1263-72.
[4] MOSMANN T. Rapid colorilmetric assay for cellular growth and survial: Application to proliferafion and
cytoxicity assays[J]. J lmmunol Methods, 1983, 65: 55-59.
 

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