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整合蛋白β1在藻蓝蛋白克制白血病细胞系K562细胞增殖中的感化

文章来源: 宾美生物科技 teammirza.com   发布时间: 2013-08-22 20:37 浏览: 

 作者:牛志云,潘崚,刘英杰,张学军,索晓慧

【摘要】    本研究不雅察不合浓度藻蓝蛋白(phycocyanin)对K562细胞增殖的影响,并检测藻蓝蛋白处理后细胞外面整合蛋白β1表达和胞内黏着斑激酶(FAK)基因表达的变更,商量整合蛋白β1在藻蓝蛋白克制K562细胞增殖中的能够感化机制。用流式细胞术(FCM)检测藻蓝蛋白处理前后K562细胞外面整合蛋白β1表达变更;MTT法测定不合浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖的影响;RT-PCR检测不合浓度藻蓝蛋白对K562细胞内FAK基因表达的感化。成果注解:整合蛋白β1在K562细胞上高表达;藻蓝蛋白不克不及改变其表达量。不合浓度藻蓝蛋白对K562细胞的增殖均有克制造用。藻蓝蛋白可上调胞内FAK的基因表达程度,恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖克制旌旗灯号。结论:藻蓝蛋白能够经过过程加强细胞基质与K562细胞外面的整合蛋白β1结合,上调K562细胞内FAK基因表达程度,恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖克制旌旗灯号而发挥克制K562细胞增殖的感化。

【关键词】  藻蓝蛋白;整合蛋白;白血病; K562细胞; 细胞增殖

  Effects of Integrin β1 on Phycocyanin Inhibiting  Proliferation of K562 Cells 
Abstract    This study was purposed to investigate the effect of phycocyamin at different concentration on proliferation of K562 cells,to detect the changes of  integrin β1  expression and intracellular focal adhesion kinase (FAK) gene expression on the surface K562 cells treated with phycocyanin,and to explore the possible machanism of integrin β1  effect on phycocyanin inhibiting proliferation of K562 cells.   The expression level of integrin β1 on the surface of K562 cells was evaluated by flow cytometry (FCM);  the growth of K562 cells treated with phycocyanin was measured by MTT  assay; the expression level of FAK  mRNA was analyzed by relatively quantitative RT-PCR after four-day culture of K562 cells with phycocyanin  of 40 μg/ml,80 μg/ml and 160  μg/ml,respectively. The results showed that integrin β1 expression on the surface of K562 cells was significantly higher than that in bone marrow mononuclear cells (BMMNC) from normal subjects.  Phycocyanin could not change the level of integin β1  expression.  Phycocyanin could increase the expression of FAK gene on K562 cells and inhibit the proliferation of K562 cells.  It is concluded that  phycocyanin can inhibit the proliferation of K562 cells through  enhancing the conjunction of cell stroma with integrin  β1  on K562 cell surface,up-regulating the expression level of FAK gene in K562 cells,restoring the signaling pathway of proliferation inhibition mediated by integrin  β1.  The possible mechanism of phycocyanin in the proliferation inhibition of K562 cells is to increase the expression of FAK gene.  The phcocyanin may be considered as a potential agent for inhibition of cancer cell proliferation.

  Key words    phycocyanin; integrin;  leukemia;  K562 cell; cell proliferation

    藻蓝蛋白(phycocyanin)是螺旋藻中的一种有效成分,可进步机体的免疫力,抵抗疾病的产生[1]。研究发明,藻蓝蛋白对体外培养的HeLa、HL-60、K562和U-937等细胞的发展有较强克制造用[2],但其克制细胞发展的感化机制尚不清楚。

    慢性粒细胞白血病(CML)患者体内存在的CML ph+细胞可异常增殖并回避凋亡。研究证明,CML ph+细胞的这些特点与整合蛋白β1介导的黏附及增殖克制功能存在妨碍密切相干[3]。近年来研究注解,整合蛋白β1活化抗体8A2可明显改良CML ph+细胞的黏附功能;搅扰素可经过过程降低ph+细胞内整合蛋白旌旗灯号通路中的黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的过度磷酸化,增长正常功能状况的FAK含量,加强整合蛋白介导的增殖克制造用[4,5]。本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞为研究对象,经过过程检测藻蓝蛋白对K562细胞的增殖影响,其实不雅察整合蛋白β1在此过程当中所发挥的感化及FAK基因表达的改变,商量藻蓝蛋白能否经过过程恢复整合蛋白β1的功能而发挥其克制肿瘤细胞增殖感化的。

  材料和办法

  细胞系与试剂

  CML急变期细胞系K652细胞由河北医科大年夜学细胞生物教研室惠赠,正常人的骨髓单个核细胞(BMMNC)和CML急变期病人BMMNC采自临床标本。鼠抗人整合蛋白β1单克隆抗体和羊抗鼠荧光抗体FITC购自苏州Coulter公司。胎牛血清、RPMI 1640培养液和四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于华丽公司。藻蓝蛋白由衡水博生生物公司惠赠,用前以无菌三蒸馏水稀释成所需浓度。小鼠IgG同型对比抗体购自鼎国生物公司。TRIZOL  RNA提取液、随机引物、M-MLV逆转录酶及TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR反响体系均购自华丽生物工程公司。FAK引物由Primer 5.0软件设计,北京赛百盛基因技巧无限公司分解。

  悬浮培养模型的建立

  K562细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,于37℃、5% CO2及饱和湿度下培养。取对数生经久细胞,以5×106/ml细胞接种于24孔板。藻蓝蛋白终浓度分别为40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml。

  K562细胞整合蛋白β1表达程度的流式细胞术测定

 搜集对数生经久细胞并调剂细胞密度为5×106/ml,取细胞悬液100 μl,一组加10 μl抗整合蛋白β1(CD29)单克隆抗体,另外一组加小鼠IgG为同型对比,稍微混匀,4℃避光放置30分钟;离心去上清,用冷PBS洗濯2遍,去除多余抗体;分别参加羊抗鼠FITC二抗10 μl 及冷PBS 100 μl,吸打混匀,4℃避光放置30分钟;用冷PBS洗濯后将细胞重悬于200 μl冷PBS中,混匀并移至流式公用管内,应用FACS Calibur流式细胞仪检测整合蛋白β1表达阳性的细胞率,应用CellQuest软件分析数据。

     不合浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖影响的MTT比色法测定

    取对数生经久的浓度为5×106/ml的K562细胞悬液,按每孔1 ml接种到24孔平底培养板中,设3个藻蓝蛋白浓度实验组(40 μg/ml组、80 μg/ml组、160 μg/ml组),每组各设6个平行孔,持续培养1-6天落先行检测。从24孔板中每孔移取50 ml细胞液于96孔板的照应孔中,别的设阴性对比组。于培养停止前4小时在96孔板中每孔参加1 0 μl MTT溶液(5 mg/ml),离心弃上清,参加200 μl DMSO,充分融化结晶物,然后用酶标仪测490 nm处吸光度A值,绘制细胞发展曲线。细胞增殖克制率=(1-处理组A值/对比组A值)×100%。

 RNA提取和浓度测定

  分分袂心搜集各组K562细胞,用TRIZOL抽提总RNA。用2%琼脂糖凝胶电泳剖断提取的RNA的完全性其实不雅察其降解情况,在紫外分光光度仪上测定RNA样品A260 和A280比值。再用DEPC水将各组总RNA调剂至同一浓度。

  各组K562细胞内FAK mRNA表达程度的RT-PCR检测

  20 μl逆转录体系中含50 μg/ml随机引物1 μl,5×逆转录反响缓冲液4 μl,10 mmol/L dNTP  2 μl,50 U/μl  RNasin 0.5 μl,M-MLV逆转录酶15 U,余用DEPC水补足20 μl。于37℃、60分钟逆转录2 μg总RNA中的mRNA为cDNA,95℃ 反响5分钟后终止反响。应用50 μl反响体系同时扩增目标基因和GAPDH基因,详细轮回参数以下: 94℃预变性2分钟进入轮回,94℃变性40秒,54℃退火1分钟,72℃延长1分钟,经40个轮回扩增后72℃延长10分钟。GAPDH基因上游引物:5’-CGGGAAGCTTGTGATCTT TGG-3’; 下游引物:5’-GGCATGGATGGCATGGACTGA-3’;引物扩增片段长度为358 bp。FAK上游引物:5’-TTGCGGAGAATATGGCTGACCTAA-3’; 下游引物:5’-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGTTC-3’; 引物扩增片段长度为116 bp。取10 μl  RT-PCR产品及10 μl  DNA marker停止1.5%琼脂糖凝胶电泳,采取MULIT IMAGE凝胶图象分析仪停止吸光度扫描,不雅察条带的灰度强弱,成果以目标基因与GAPDH的积分吸光度的比值表示。

  统计学处理

  数据均以均数±标准差( X±SD)表示,应用SPSS 10.0软件停止统计分析。多组间均数差别性比较采取单身分方差分析(one-way ANOVA)中LSD考验,P<0.05即认为有统计学意义。

  成果
 
K562细胞高表达整合蛋白β1

  经FCM测定,正常人BMMNC和K562细胞整合蛋白β1(CD29)阳性表达率分别为72.40±3.56%和99.24±0.52%,后者较前者明显增高(P<0.05)。CML急变期病人BMMNC整合蛋白β1阳性表达率为93.43±1.67%,较正常人组明显增长(P<0 05)。这些成果注解,K562细胞和CML病人BMMNC整合蛋白β1表达降低。藻蓝蛋白处理后K562细胞整合蛋白β1阳性表达率与未处理组比较无明显改变(图1)。

  藻蓝蛋白克制K562细胞增殖
  
MTT检测成果显示,各浓度藻蓝蛋白处理组的K562细胞增殖克制率较对比组均明显降低(P<0.01),并呈剂量依附性的变更;且以藻蓝蛋白孵育4天对K562细胞增殖的克制造用最明显,40、80和160μg/ml组第4天细胞克制率分别为24.76%±4.96%、37.95%±5.13%和46.61%±2.64%(附表)。Tabel . Inhibition rate of phycocyanin (PC)  with  different concentrations on K562 cells analyzed by MTT test (略)

  各组K562细胞的总RNA提取和剖断

  各组总RNA用紫外分光光度仪测定其A260 和A280 比值,成果显示比值均在1.8-2.0范围,证明了总RNA的完全性。1.5%琼脂糖凝胶电泳可见5S、18S、28S  3条特点带,且28S条带含量约是18S条带的2倍,上样孔四周无明显EB染色出现,注解无降解和DNA污染,纯度附合请求。

  藻蓝蛋白对K562细胞内FAK mRNA表达程度的影响

  检测成果如 图2所示,各组PCR产品条带的FAK/GAPDH光密度比值分别为:0.40(对比组)、0.88(40     μg/ml组)、1.03(80 μg/ml组)、0.91(160 μg/ml组)和1 36(正常人BMMNC)。与正常人BMMNC比较,K562细胞内FAK基因表达明显降低;不合浓度藻蓝蛋白处理4天后K562细胞内FAK基因表达明显增长,但各浓度组间无剂量依附性。

  评论辩论

  藻蓝蛋白是螺旋藻的重要组分之一。研究注解,藻蓝蛋白有较高的心思活性和药用价值,如防治肿瘤,进步机体免疫力,促进植物血细胞再生等[6]。本实验再次证明了藻蓝蛋白克制肿瘤细胞发展的感化。我们发明,藻蓝蛋白对人白血病细胞株K562细胞增殖的克制造用与细胞外面的整合蛋白β1的功能相干。为了解释其感化机理,我们做了进一步研究。

    FCM成果显示,在CML急变期病人的BMMNC和K562细胞外面整合蛋白β1均高表达,而藻蓝蛋白其实不改变其表达量。业已证明,整合蛋白β1的高表达与CML祖细胞中的P210融合蛋白的安慰有关,且P210蛋白对其正常旌旗灯号的转导有克制造用。另外,Lundell等[7]经过过程克隆构成实验发明,ph+细胞的整合蛋白介导的发展克制旌旗灯号转导功能存在缺点。是以我们推想,藻蓝蛋白能够经过过程改良整合蛋白β1的功能缺点,而非改变其表达量发挥感化。为了证明这一点,我们检测了藻蓝蛋白处理组K562细胞内FAK的基因表达程度。

    尽人皆知,FAK处于整合蛋白旌旗灯号通路与发展因子旌旗灯号通路的交汇点,在发展因子受系一切与整合蛋白协同调理细胞的活化、增殖、凋亡等活动中发挥重要感化[8]。它是一种胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶,参与了细胞内多种旌旗灯号转导门路,并在旌旗灯号转导中起承上启下的感化[9]。RT-PCR检测成果注解,K562细胞与正常人BMMNC比拟,FAK基因表达程度明显降低。藻蓝蛋白处理后K562细胞内FAK基因表达程度明显增长。是以我们推想,藻蓝蛋白能够经过过程克制P210融合蛋白引诱FAK产生过度磷酸化,进步胞内具有正常功能的FAK表达量和活性,而恢复整合蛋白β1旌旗灯号通路对CML ph+细胞增殖的负调控。此成果与常铉等[5]的实验成果分歧,从而证明恢复整合蛋白β1对CML ph+细胞的增殖克制功能是治疗CML的有效门路之一。同时本研究也证明,藻蓝蛋白实在其实有抗肿瘤的功能,是一种很有开辟潜力的药物。

【参考文献】
    1 姚宝贞. 螺旋藻的养分价值及其保健功能. 食品研究与开辟,1998; 6:2-5

2 张成武,刘宇峰,王习霞等. 螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL-60,K-562和U-937的发展影响. 陆地迷信,2000;24:45-48

3 Salesse S,Verfaillie CM. Mechanisms underlying abnormal trafficking and expansion of malignant progenitors in CML: BCR/ABL-induced defects in integrin function in CML. Oncogene,2002; 21:8605-8611

4 Verfaillie CM,Hurley R,Lundell BI,et al. Integrin-madiated regulation of hematopoiesis: do BCR/ABL-induced defects in integrin function underlie the abnormal circulation and proliferation of CML progenitors? Acta Haemaol,1997; 97:40-52

5 常铉,刘晓力,杜庆锋等. 慢性髓系白血病粘附相干分子整合素β1及部分粘了会激酶的研究. 第一军医大年夜学学报,2003; 23:1047-1049

6 彭卫平易近,商树平易近.钝顶螺旋藻藻胆蛋白性质的研究. 中国农业大年夜学学报,1999; (4):35-38

7 Lundell BI,McCarthy JB,Kovach NL,et al. Activation-dependent alpha5 beta1 integrin-madiated adhesion to fibronectin decreases prolixferation of chronic myelogenous leukemia progenitors and K562 cells. Blood,1996; 87:2450-2458

8 倪俊,陈玉林. 粘着斑激酶.心思迷信停顿,1999;30:367-372

9 彭旭,徐雅琴. 粘着斑激酶.国外医学·分子生物学分册,1999;21:65-69.

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