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红藻藻蓝蛋白对HL-60细胞发展的克制造用

文章来源: 宾美生物科技 teammirza.com   发布时间: 2013-08-22 20:33 浏览: 
红藻藻蓝蛋白对HL-60细胞发展的克制造用
中国陆地药物 2000年第1期第19卷 研究申报
作者:刘宇峰 徐力致 张成武 魏海燕 李恒
单位:刘宇峰 徐力致 魏海燕 李恒(南京大年夜学医学院,南京 210093);张成武(南京化工大年夜先生物工程与技巧系)
关键词:红藻藻蓝蛋白;HL-60;半固体琼脂培养法;MTT法;流式细胞仪;免疫印渍法
摘 要:本文应用半固体琼脂培养法及MTT法研究了红藻藻蓝蛋白(R-PC)对HL-60细胞发展的影响,成果发明:R-PC可以或许明显克制细胞的发展,且存在浓度效应和时间效应关系。为进一步摸索R-PC克制HL-60细胞发展的能够机制,将不合浓度的R-PC与HL-60细胞相互感化6d后,分别用流式细胞仪检测HL-60细胞所处细胞周期中的时相和免疫印渍法测定HL-60细胞中Bcl-2基因表达产品的变更,实验成果显示:R-PC确能使更多的HL-60细胞滞留于细胞周期的G0-G1期,但与R-PC浓度无正向关系,且HL-60细胞中Bcl-2基因表达产品的量也没有明显的变更。成果注解:R-PC能够经过过程不合于G0-G1期滞留及Bcl-2基因表达的机制克制HL-60细胞的发展。
THE INHIBITION OF PHYCICYANIN FROM PORPHYRA HAITANENSIS ON THE GROWTH OF HUMAN LEUKEMIA HL-60 CELLS
liu Yufeng Xu Lizhi Zhang Chengwu Wei Haiyan Li Heng
(Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093)
ABSTRACT:The effect of phycocyanin from Porphyra haitanensis on the growth of human leukemia HL-60 cells was studied by semi-solid culture method and MTT staining assay. The results showed that the phycocyanin could significantly inhibit the growth of HL-60 cells in a dose- an time-dependent manner. In order to elucidate the potential pathway of the phycocyanin affecting the growth of HL-60 cells treated with phycocyanin at different concentrations for 6 days were further checked by flow cytometric assay and western blot analysis. Flow cytometric assay demonstrated that more HL-60 cells underwent G0-G1 arrest,but there were not evident differences between the experimental groups and the control. Western bolt analysis indicated that the expression level of Bcl-2 protein remained unchanged.These findings suggested that the phycocyanin could inhibit the growth of HL-60 cells by the potential pathways other than G0-G1 arrested or the expression change of Bcl-2 protein.
KEY WORDSPhycocyanin from Porphyra Haitanensis, HL-60 cells Semi-solid agar, MTT staining assay, Flowcytometric assay, Westem Blot analysis.▲
随着迷信技巧的生长,开端掀起了研究陆地活性物质,特别是海藻的高潮[1]。有研究注解:陆地生物的提取物,如藻类多糖、多肽和藻蓝蛋白可以或许影响肿瘤细胞的增殖[2,3]。藻蓝蛋白是某些藻类独有的捕光色素蛋白,因其具有能溶于水和化学性质稳定等特点,因此在免疫检测、荧鲜明微技巧和流式细胞仪技巧方面,是一种很好的生化示踪物[4]。有实验证明,藻蓝蛋白具有某些抗肿瘤活性[5],对癌激光治疗有增敏感化[6],并对小鼠粒单系祖细胞具促进发展的感化[7]
本实验所用红藻藻蓝蛋白(R-PC),来源于坛紫菜(Porhyra haitanensis),其最大年夜接收峰为558nm和617nm,λFmax为635nm,其分子量为117000,等电点为4.62。为了研究红藻藻蓝蓝白对肿瘤细胞发展的影响,更深刻懂得R-PC的理化性质,摸索其成为肿瘤克制物的能够性,本文研究了R-PC对HL-60细胞发展的影响。
1 材料和办法:
1.1 材料
1.1.1 R-PC:南京化工大年夜先生物工程与技巧系张成武供给。
1.1.2 RPMI 1640和MTT分别为美国Gibco和Sigma公司产品。
1.1.3 小牛血清:杭州四时青生物原料研究所产品。
1.1.4 抗Bcl-2蛋白单克隆抗体:上海华丽公司产品。
1.1.5 HL-60细胞:购于中科院上海细胞所细胞库。
1.2 实验办法
1.2.1 HL-60细胞的培养:用含10%小牛血清的RPMI完全培养液培养HL-60细胞至对数生经久,计数后分别停止以下检测。
1.2.2 半固体琼脂培养法[8]:基层琼脂浓度为0.5%,个中含16%RPMI 1640(4X)和20%小牛血清。下层琼脂浓度为0.3%,个中除含与基层琼脂雷同的RPMI 1640和小牛血清外,还含HL-60细胞(4×103/ml)及R-PC(40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml3个浓度组,每个浓度组12d雷异样本),正常对比则不加R-PC。置37℃,5%CO2浓度条件下培养4、6、8、10、12天停止集落计数(大年夜于20个细胞的细胞团为一个集落)。
1.2.3 MTT检测法[9]:用RPMI 1640完全培养液将HL-60细胞稀释至2×104/ml,分别于24孔培养板中每孔加细胞悬液1ml,并参加照应的R-PC使其终究浓度分别为40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml,每个浓度设6个雷异样本,对比组则不如R-PC,置CO2培养箱中培养至2、4、6、8、10天,从每孔汲取100μl细胞悬液,停止MTT检测,并于波长570nm处测OD值。
1.2.4 流式细胞仪检测(由南京铁道医学院分析细胞室检测):将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d,搜集HL-60细胞,用冷的PBS洗3次,用70%酒精固定。临检测前用PBS洗2次,分别加Tritun-α-100 1ml,静置4℃ 10min,离心去上清,加1ml 0.01%RNA酶静置10min,离心去上清,加1ml0.005%PI(碘化丙啶),300目尼龙网过滤,置4℃冰箱15min后,用FACS Calibur(美国B.D公司)流式细胞仪检测,并用Cell Quest 软件搜集,用Modfit 软件分析HL-60细胞所处于细胞周期中时相。
1.2.5 免疫印渍法检测Bcl-2基因表达产品的变更[10]:将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d,搜集HL-60细胞,用冷的PBS洗3次,水浴条件下用裂解缓冲液裂解HL-60细胞,离心,测定上清中的蛋白浓度。经12%的SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维膜上。该硝酸纤维膜经5%脱脂奶粉封闭后,分别与一抗(鼠抗Bcl-2单克隆抗体)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)反响,最后用DAB显色其实不雅察实验成果。
2 实验成果
2.1 R-PC对HL-60细胞集落构成的影响:表1成果显示,与对比组比拟,实验组3在培养至第4、6、8、10、12d都存在异常明显的差别,实验组1、2在第6d落第12d与对比组间也分别存在明显的差别。 表1 R-PC对HL-60细胞集落构成的影响
培养天数 4 6 8 10 12
R

PC

对比组
给药组
(μg/mg)
  40
80
160
3.1±0.74
2.9±0.74
2.6±0.70
1.9±0.56**
3.8±0.63
3.0±0.82*
2.7±0.67**
2.0±0.47**
4.2±0.63
3.4±0.84
3.2±0.92
3.1±0.74**
4.5±0.97
4.2±0.79
4.0±0.67
3.1±0.74**
4.7±0.95
3.7±0.67*
3.0±0.82**
3.2±0.79**
f-考验,*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)2.2 R-PC对HL-60细胞MTT OD值的影响:表2显示:与对比组比拟,实验组3在第2、4、6、8、10d都存在异常明显的差别;实验组2在第2d存在明显的差别,在第4、6、8、10d都存在异常明显的差别;实验组1则在第4、6、8d都存在异常明显的差别,在第10d存在明显的差别。将表2成果与表1比拟较,R-PC浓度为160μg/ml时对HL-60细胞的发展克制成果异常分歧,其他两种浓度下在不合的感化时间下的成果有些差别,但都说清楚明了R-PC对HL-60细胞的发展具有明显的克制造用。
表2 R-PC对HL-60细胞MTTOD值的影响。
培养天数 4 6 8 10 12
R

PC

对比组
给药组
(μg/mg)
  40
80
160
0.02±0.025
0.18±0.022
0.17±0.014*
0.14±0.021**
0.40±0.029
0.26±0.042**
0.30±0.035**
0.25±0.046**
0.61±0.056
0.53±0.065**
0.52±0.014**
0.34±0.035**
0.88±0.072
0.38±0.049**
0.36±0.035**
0.31±0.042
0.56±0.049
0.49±0.028*
0.38±0.028**
0.29±0.023**
f-考验,*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)
2.3 流式细胞仪检测:R-PC与HL-60细胞合营培养6d后,与对比组比拟,HL-60细胞处于细胞周期G0-G1期的百分率都有不合程度的增长,而处于S期的HL-60细胞则照应增添,并且这类时相的变更与R-PC的浓度成必定的反向效应(表3)。能够是HL-60细胞本身的原因或处于G2/M期的HL-60细胞较少的缘由,在分析过程当中,处于这时候代的HL-60细胞被忽视了,因此没能测出这部分处于G2/M时相的细胞。 表3 R-PC对HL-60细胞处于细胞周期时相的影响
时相 G0-G1期(%) S期(%)

对比组
给药组
(μg/ml)
  40
80
160
31.66
34.86
33.37
32.52
68.34
65.14
66.63
67.48
2.4 免疫印渍法检测:R-PC与HL-60细胞合营培养6天后,与对比组比拟较,实验组Bcl-2基因表达产品量没有明显差别,且实验组之间,HL-60细胞的Bcl-2基因表达量也没有明显变更。3 评论辩论
随着陆地生物药物研究的深刻,已发清楚明了很多诸如海藻陆地生物体内存在多种抗肿瘤的生化活性物质[11]。藻蓝蛋白作为藻类家族中的重要成员,在某些藻类中含量极其丰富,是一种完全无毒的蛋白质资本[12]。因藻蓝蛋白对一些肿瘤细胞的发展具克制造用或帮助杀伤感化[5,6],因此其重要性已日趋为人们所看重。从表1和表2可知:R-PC在160μg/ml浓度下对HL-60细胞的集落构成及MMT OD值存在异常明显的克制造用,在40和80两种浓度下,都在第6d和第12d对HL-60细胞的集落构成有明显或异常明显的克制造用,对HL-60细胞MTT OD值都有明显或非常明显的影响。这些成果都注解:R-PC对HL-60细胞的发展有明显的克制造用。
为了进一步摸索R-PC克制HL-60细胞发展的能够机制,将HL-60细胞与R-PC合营培养6d后,用流式细胞仪和免疫印渍法分别检测了HL-60细胞所处于细胞周期中的时相及HL-60细胞中的Bcl-2基因表达产品的变更情况。表3-注解:在R-PC感化6d后,处于G0-G1期的HL-60细胞的百分率较对组略有增长,其照应处于S期的HL-60细胞数则照应增添。滞留于细胞周期G0-G1期HL-60细胞增多,能够会使部分HL-60细胞因停止增殖。但HL-60细胞滞留于G0-G1期的数量增多并没有与R-PC的浓度出现正相干性。由于滞留于G0-G1期的细胞增多能够与细胞产生法式榜样性相干[13],经流式细胞仪检测,R-PC与HL-60细胞感化6d后,确有极少部分HL-60细胞产生了法式榜样性逝世亡,但与R-PC的浓度无相干性,且经琼脂糖电泳检测,也没见到典范的梯形条带出现。这些成果解释克制HL-60细胞增殖能够不是经过过程法式榜样性逝世亡这一机制完成的。
由于Bcl-2基因可以或许拮抗多种试剂激起的细胞逝世亡[14],我们在实验中用免疫印渍法检测了经R-PC感化6d后的HL-60细胞的Bcl-2基因表达产品的变更情况。成果注解:HL-60细胞中的Bcl-2基因的表达与有没有R-PC感化无明显相干性,解释R-PC也没有激起Bcl-2基因表达,Bcl-2基因表达产品的变更能够与R-PC对HL-60细胞的克制造用无直接相干性。
至于R-PC重要经过过程何种机制来克制的发展,今朝还不清楚。已有报导:藻蓝蛋白能明显减轻辐射对小鼠外周血细胞和骨髓细胞的毁伤,加快外周血白细胞和骨髓有形细胞的恢复[12]。藻蓝蛋白能够作为一种DNA稳定因子起感化[15],与藻蓝蛋白同属藻类重要成分的多糖,主如果经过过程克制NDA分解的机制来克制肿瘤细胞发展[16]。R-PC克制HL-60细胞的发展,能否是经过过程影响分解DNA和RNA的机制,或以引诱HL-60细胞内信息分子的改变来完成的,还需进一步研究。
参考文献:
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